双抗副产物的下游工艺策略

2024年06月21日 10:02:25来源：百林科医药科技（上海）有限公司

　　双特异性抗体(Bispecific antibody，BsAb，简称双抗)是指能够特异性的结合两个抗原或两种特异性表位的人工抗体。

　　根据双抗结构划分，可分为IgG-like双特性异性(含有Fc区)和non-IgG-like双特异性抗体(不含Fc区)。IgG-like双特性异性:含有FC区，分子量相对较大，FC区也有助抗体后期的纯化。可提高溶解性，稳定性，具有FC介导的效应功能。

　　Non-IgG-like双特异性抗体：非IgG-like双抗在设计时去除了FC区，分子量一般较小，渗透性强，半衰期短，相对而言具有易于生产的特点。

双抗不同类型分子结构图

　　双抗在重组表达过程中会不可避免的产生错配，不完整片段，以及聚集等副产物，这些双抗的副产物主要分为：①错配(主要包括重链之间错配引起的同源抗体，轻链与重链之间错配引起的异源抗体)，②抗体片段(缺失重链和轻链的双抗副产物：如半抗体，3/4抗体)，③聚体(轻链聚集体，重链聚集体)等，这些双抗副产物为双抗药物的下游工艺提出了较大的挑战。

典型的双抗杂质表现
(2021 Current trends and challenges in the downstream purification of bispecific antibodies)

　　针对不同的双抗类型，需要多样化的纯化平台来进行杂质的去除，通常可以进行以下路线的选择：

不同杂质类型可选择填料种类

亲和层析纯化

　　Protein A亲和层析在双抗纯化中具有捕获和除杂的功能，是使用最多的一种层析方法。典型的亲和层析是pH7.2±0.2的缓冲液中上样，平衡缓冲液淋洗，醋酸，柠檬酸或甘氨酸缓冲液含有300~1000mM氯化钠在pH5.0~6.0条件下洗杂，然后使用醋酸，柠檬酸或甘氨酸缓冲液在pH4.0~2.5条件下洗脱或者梯度洗脱。Protein A可以去除同源抗体，半抗及3/4抗体。对于一般难以去除的副产物，可以通过添加一定成分的添加物进行去除，比如：在洗脱和洗杂缓冲液中添加CaCl2可以提高半抗和同源聚体的去除；在洗脱和洗杂缓冲液中添加精氨酸可以提高半抗，工艺残留的去除；在洗脱和洗杂缓冲液中添加MgCl2可以提高同源聚体的去除。

　　MaXtar® ARPA是一款耐0.5 mol/L碱，高载量，高分辨率的Protein A填料，在半抗，3/4抗体，同源聚体，单链缺失及聚体类双抗副产物去除表现良好。目前广泛应用在多个抗体药物的商业化生产中。

离子交换层析纯化

　　离子交换层析是利用双抗与双抗副产物的等电点PI的差异，通过盐梯度或pH梯度进行分离纯化，在抗体纯化应用最多的精纯步骤。一般情况下，只要双抗与双抗副产物的PI差异在0.5以上，就可以使用离子交换层析分离开。离子交换层析可以去去除同源聚体，3/4抗体，聚体。对于特别难以去除的3/4抗体，可以优化缓冲液中添加PEG，CaCl2，精氨酸等，使用pH梯度的阳离子交换层析，可以获得较好的去除效果。

　　MaXtar® Q、MaXtar® Q HR、MaXtar® S/SP、MaXtar® SP HR在抗体纯化中应用比较经典的离子交换层析填料。MaXtar® S HC是一款高分辨，高载量(可达100mg IgG/ml以上的填料)的阳离子交换层析填料。

疏水层析纯化

　　疏水层析根据双抗与双抗副产物的疏水性差异进行分离。在高盐浓度下，双抗表面疏水残基暴露，与疏水填料表面结合，随盐浓度的降低，使得不同疏水强度的双抗与双抗副产物进行分离。高盐浓度的缓冲液可能使蛋白与层析填料产生不可逆结合，在疏水缓冲液中添加5~15%的PEG或精氨酸可以促进洗脱和提高洗脱效果，增加回收率；也可使用高分辨率的MaXtar® Phenyl HR或MaXtar® Butyl HR的层析填料，以结合或流穿模式去除聚体。

　　MaXtar® Phenyl、MaXtar® Phenyl HR、MaXtar® Butyl、MaXtar® Butyl HR在双抗纯化可以有效的去除重链和轻链，聚体等双抗副产物。

复合层析纯化

　　混合模式层析利用层析填料的两种或两种以上相互作用机理进行分离的方法。比如：CHT可同时实现阳离子交换和钙金属亲和两种分离机制及MMC/MMA具有弱阳离子/阴离子交换和疏水层析两种层析机理，可取去除同源聚体；由于复合模式层析的双机理的分离功能，在去除双抗副产物种具有独特效果。混合模式层析在双抗纯化种应用非常广泛。

图1：BarconCHT Type I的双抗层析图谱

表1：BarconCHT Type I纯化双抗的收率与纯度

　　小结：

　　由于双抗比单抗的副产物更复杂，需要针对不同类型的双抗，依据亲和力，电荷，疏水性等性质差异，设计多种不同的下游工艺路线，去除副产物，提高双抗的纯度。百林科可以提供双抗纯化不同纯化工艺路线如表2，表3-1，表3-2，在各种双抗项目种表现优异。

表2：百林科三步层析在某双抗项目的应用

表3-1：百林科三步层析在某双抗药物的应用

表3-2：百林科三步层析在某双抗药物的备选应用

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